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转录组+代谢组专题 如何准备合格的样本(植物篇)

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8 月 28, 2023 #菌类文献

样本的准备是开始转录组+代谢组项目的第一步,也是决定一个项目能否成功的最关键环节。样本取样及时,合理,后续实验数据有代表性,挖掘数据时更有针对性。转录组+代谢组项目,设计到两个组学,所以取样时需要更加严格。植物相关的研究中,常见的样本类型包括植物组织样本,细胞样本,微生物样本。

下面我们从取样准备,转录组+代谢组取样原则,不同样本类型取样流程,送样量要求及样本包装和寄送来进行详细阐述,帮助老师顺利开展实验。(点此阅读原文)

由于在液氮速冻之后,锡箔纸、自封袋、封口膜等类型的包装容易在运输过程中发生破裂,导致样品混杂,因此在样品保存的时候要求用离心管进行包装;同时要求包装的内容物不能超过离心管体积的70%,过大的样品量容易造成离心管破裂。

单一变量原则。在条件允许的前提下,争取做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面可能保持一致。

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录。选择3-5株样本取样,充分混合后分为两份,分别进行转录组,代谢组检测。

样本离体后,分离步骤在 4℃或冰上进行,分离后的样本立即置于液氮中速冻,-80℃保存,干冰运输。

1)优先选择正常生长发育的植株幼嫩部位;因为胁迫处理使得植株生长状态较差的也可以进行取样,尽量避免选择因为处理时间过久已经死亡的植株,从培养植株中选择3-6株长势一致植株作为一个生物学重复样品的来源,避免因为个体差异过大带来的差异;

2)植物样品采集时建议用PBS/RNase-free水擦拭或冲洗干净,再用吸水纸吸干样品表面;

3)组织体积较大时,将组织剪切成50-100mg小块,组织处理及切割在冰上快速进行,时间过长导致样品RNA降解,液氮速冻后放入预冷螺纹的EP管中;

5)将处理好的组织样本混合均匀后分管保存,将转录组与代谢组样本在取样时分开,避免后期分样时样本冻融导致的RNA降解;

7)为确保实验的顺利,建议样品备份1-2份,以防备部分样品降解重新取材、制备或送样,耽误时间。

在植物RNA提取过程中,有两类物质会影响提取,多酚和多糖。多酚类物质氧化后回和RNA稳定结合,影响RNA纯度,而且随着植物生长,植物中的酚类物种会增多。多糖类物质,多糖的理化性质和RNA相似,去除多糖的同时会带走一部分RNA,另外在沉淀RNA时,多糖会形成凝胶状沉淀,会影响RNA总量和纯度。

类似玉米叶片这种长叶片和大叶片,建议叶尖、叶中、叶基部各取一部分混一起,或者都取同一个部分。切忌有的取叶尖、有的取叶中,有的取叶基部组织。

1)倒掉培养基,加入1.5mL无菌1×PBS溶液,用移液枪吹打细胞,直到细胞全部脱离瓶底为止;

2)对于贴壁牢固的培养细胞,可以用细胞刮勺剥离细胞。将细胞连同PBS溶液一起收集到无核酸酶的2.0mLEP管中,300-500×g(1100-1500rpm)离心5分钟,弃 上清,收集沉淀细胞;

3)离心收集的细胞立即速溶于TRIzol裂解,参考用量为每1×106个细胞加1mLTRIzol,细胞溶于TRIzol后,如出现成团,需用吸头将细胞团吹打散,或者激烈震荡混匀,使细胞完全溶于TRIzol中充解,充解后的样本分成两管,一管用来做转录组,一管用来做代谢,之后转移至-80℃低温保存,送样时选择干冰运输寄送;

1)倒掉培养液,用无菌1×PBS溶液洗涤细胞,然后加入正好能盖住单层细胞的胰酶溶液:如150mm培养瓶需加入2mL胰酶溶液,100mm培养皿需加入1mL胰酶溶液。轻轻晃动器皿使胰酶均匀分布在细胞层上,直到细胞松动(一般1-2分钟);

2)一旦细胞松动,尽快弃去胰酶溶液(倾斜平皿或培养瓶以便用枪头尽量吸去多余的溶液),加入1×PBS溶液,用移液枪吹下贴壁的细胞;

3)将细胞连同PBS溶液一起收集到Nuclease-free的螺纹旋盖的EP管中,300-500×g(1100-1500rpm)离心5分钟,弃上清,收集沉淀细胞;

4)离心收集的细胞立速溶于TRIzol裂解,参考用量为每1 × 106个细胞加1mLTRIzol;细胞溶于TRIzol后,如出现成团,需用吸头将细胞团吹打散,或者激烈震荡混匀,使细胞完全溶于TRIzol中充解;充解后的样本分成两管,一管用来做转录组,一管用来做代谢,之后转移至-80℃低温保存,送样时选择干冰运输寄送;

1)将悬浮的细胞连同培养液一起倒入合适的离心管中,300-500×g(1100-1500rpm)离心5分钟;

2)使用无菌1×PBS溶液洗涤沉淀的细胞,转入1.5或2.0mL离心管中,300-500×g(1100-1500rpm)离心5分钟,弃上清,收集沉淀的细胞;

3)离心收集的细胞立速溶于TRIzol裂解,参考用量为每1×106个细胞加1mLTRIzol;细胞溶于TRIzol后,如出现成团,需用吸头将细胞团吹打散,或者激烈震荡混匀,使细胞完全溶于TRIzol中充解,充解后的样本分成两管,一管用来做转录组,一管用来做代谢,之后转移至-80℃低温保存,送样时选择干冰运输寄送;

1)除去培养基,收集菌体后,进行混合,后分为两管,一份用来做转录一份用来做代谢,避免后期冻融后分管导致RNA样品降解,分样后立即液氮速冻,-80℃保存,干冰寄送;

3. 寄送过程中要求干冰保存,为了防止样品运输途中由于干冰挤压而损坏,建议将EP管放置在冻存盒中。

4. 长年保存的组织:组织样本保存时间超过一年或以上,RNA提取风险加大,RNA质量较差,不建议送样。此类组织包括植物老根、果实等鉴于这类组织RNAase非常活跃的特点,组织部位离体后,务必在半分钟内将离体组织用液氮速冻,放入-80℃冰箱中保存。如果组织离体超过1分钟未进行处理,活跃的RNase很可能以惊人的速度在降解RNA,RNA的质量难以保证。